Abstract
De snelle verspreiding van COVID-19 onderstreept de noodzaak van nieuwe behandelingen. Hier melden we dat cannabidiol (CBD), een verbinding die wordt geproduceerd door de cannabisplant, de SARS-CoV-2-infectie remt.
CBD en zijn metaboliet, 7-OH-CBD, maar geen congene cannabinoïden, blokkeren krachtig de replicatie van SARS-CoV-2 in longepitheelcellen. CBD werkt na cellulaire infectie, remt virale genexpressie en keert veel effecten van SARS-CoV-2 op gastheergentranscriptie om. CBD induceert de expressie van interferon en reguleert de antivirale signaalroute opwaarts.
Een cohort van menselijke patiënten die eerder CBD gebruikten, had een significant lagere incidentie van SARSCoV-2-infecties tot een orde van grootte in vergelijking met gematchte paren of de algemene bevolking. Deze studie belicht CBD en zijn actieve metaboliet, 7-OH-CBD,
Samenvattende zin:
Cannabidiol uit de cannabisplant heeft potentieel om SARS-CoV-2-infectie te voorkomen en te remmen
Ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is verantwoordelijk voor de ziekte van coronavirus 2019 (COVID-19), een pandemie die het afgelopen jaar de wereld heeft ingehaald. SARS-CoV-2, gerelateerd aan ernstig acuut respiratoir syndroom-gerelateerd coronavirus (SARS-CoV), is de zevende soort coronavirus waarvan bekend is dat het mensen infecteert. Deze coronavirussen, waaronder SARS-CoV, 229E, NL63, OC43, HKU1 en MERS-CoV, veroorzaken een reeks symptomen van verkoudheid tot ernstigere pathologieën ( 1 ).
Ondanks de recente beschikbaarheid van vaccins, verspreidt SARS-CoV-2 zich nog steeds snel ( 2 ), wat de behoefte aan alternatieve behandelingen benadrukt, vooral voor populaties met beperkte toegang tot vaccins. Tot op heden zijn er maar weinig therapieën geïdentificeerd die SARS-CoV-2-replicatie en virale productie blokkeren.
SARS-CoV-2 is een positief-sense enkelstrengs RNA (+ssRNA) omhuld virus dat bestaat uit een lipide dubbellaag en vier structurele eiwitten die de vorming van virale deeltjes aansturen. De spike (S), membraan (M) en envelop (E) zijn integrale eiwitten van het virusmembraan en dienen om het ontluiken van virionen te stimuleren, terwijl ook het nucleocapside (N) -eiwit en het virale genomische RNA worden gerekruteerd in ontluikende virions. Net als SARS-CoV komt SARS-CoV-2 voornamelijk menselijke cellen binnen door binding van het virale S-eiwit aan de angiotensine converting enzyme 2 (ACE2)-receptor ( 3 – 5 ), waarna het S-eiwit proteolyse ondergaat door transmembraanprotease, serine 2 (TMPRSS2) of andere proteasen in twee niet-covalent gebonden peptiden (S1, S2) die virale toegang tot de gastheercel vergemakkelijken. de N-terminal S1 bindt aan de ACE2-receptor, en de C- terminal S2 bemiddelt virale celmembraanfusie na proteolytische splitsing door TMRSS2 of andere proteasen.
Afhankelijk van het celtype kan virale binnenkomst ook optreden na ACE2-binding, onafhankelijk van proteolytische splitsing ( 6 – 8 ). Na celinvoer wordt het SARS-CoV-2-genoom vertaald in twee grote polypeptiden die worden gesplitst door twee virale proteasen, MPro en PLPro ( 9 , 10), om 15 eiwitten te produceren, naast de synthese van subgenomische RNA’s die coderen voor nog eens 10 aanvullende eiwitten plus de 4 structurele eiwitten.
Deze eiwitten maken virale replicatie, assemblage en ontluiking mogelijk. In een poging om infectie door het SARS-CoV-2 bèta-coronavirus en andere zich ontwikkelende pathogene virussen te onderdrukken, hebben we het antivirale potentieel getest van een aantal kleine moleculen die zich richten op de stressresponsroutes van de gastheer.
Een mogelijke regulator van de gastheerstress en antivirale ontstekingsreacties is cannabidiol (CBD), een lid van de cannabinoïdeklasse van natuurlijke producten ( 11 ). CBD wordt geproduceerd door Cannabis sativa (Cannabaceae; marihuana/hennep). Hennep verwijst naar cannabisplanten of daarvan afgeleide materialen die 0,3% of minder van de psychotrope tetrahydrocannabinol (THC) bevatten en die doorgaans een relatief hoog CBD-gehalte hebben.
Marihuana verwijst daarentegen naar C. sativa- materialen met meer dan 0,3% THC in droog gewicht. THC werkt door binding aan de cannabinoïde-receptor en CBD versterkt deze interactie ( 12). Ondanks talrijke onderzoeken en veel typisch ongefundeerde claims met betrekking tot CBD-bevattende producten, is de biologie van CBD zelf onduidelijk en zijn specifieke doelen meestal onbekend ( 11 ).
Een orale oplossing van CBD is echter een door de FDA goedgekeurd medicijn, grotendeels voor de behandeling van epilepsie ( 13 ). CBD heeft dus de status van medicijn, is levensvatbaar als therapeutisch middel en kan in de Verenigde Staten niet op de markt worden gebracht als voedingssupplement ( 11 ). Hoewel beperkt, hebben sommige onderzoeken gemeld dat bepaalde cannabinoïden antivirale effecten hebben tegen het hepatitis C-virus (HCV) en andere virussen ( 14 ).
RESULTATEN
Om het effect van CBD op SARS-CoV-2-replicatie te testen, hebben we A549 menselijke longcarcinoomcellen die exogene menselijke ACE-2-receptor (A549-ACE2) tot expressie brengen, gedurende 2 uur voorbehandeld met 0-10 μM CBD voorafgaand aan infectie met SARS-CoV- 2. Na 48 uur hebben we cellen gecontroleerd op expressie van het virale spike-eiwit (S).
Ter vergelijking: we behandelden cellen over een vergelijkbaar dosisbereik ook met een MLK-remmer (URMC-099) die eerder was geïmpliceerd als een antiviraal middel voor HIV ( 12 ) en KPT-9274, een PAK4/NAMPT-remmer ( 13 ) die volgens onze analyse zou kunnen worden omgekeerd. veel veranderingen in genexpressie veroorzaakt door SARS-CoV-2. Alle drie remmers remden krachtig de virale replicatie onder niet-toxische omstandigheden met EC50’s variërend van 0,2-2,1 M (Afb. 1A). CBD remde ook de replicatie van SARS-CoV-2 in epitheelcellen van de nieren van Vero E6-apen ( fig. S1A ). Bij de effectieve doses werd geen toxiciteit waargenomen ( fig. S1B ).
We hebben ook vastgesteld dat CBD de replicatie van een verwant bèta-coronavirus, muizenhepatitisvirus (MHV), onderdrukte onder niet-toxische omstandigheden met een EC50 van ~5 μM met behulp van A549-cellen die de MHV-receptor (A549-MHVR) tot expressie brengen, wat wijst op het potentieel voor een bredere virale werkzaamheid ( fig. S1C , D ).
(A) A549-cellen met ACE2-overexpressie (A549-ACE2) werden behandeld met aangegeven doses CBD, KPT-9274 of URMC-099 gevolgd door infectie met SARS-CoV-2 bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 0,5 voor 48 uur. De cellen werden gekleurd op spike-eiwit en het percentage cellen dat het spike-eiwit in elke toestand tot expressie bracht, werd uitgezet. EC50-waarden worden aangegeven. (B)
Het 1 H qNMR spectra van CBD van een referentiemateriaal en CBD monsters van drie verschillende leveranciers A, B en C. (C) A549-ACE2 cellen werden behandeld met aangegeven doseringen van CBD uit drie verschillende leveranciers, gevolgd door infectie met SARS-CoV-2 bij een MOI van 0,5 gedurende 48 uur. De cellen werden gekleurd op spike-eiwit en het percentage cellen dat het spike-eiwit in elke toestand tot expressie bracht, werd uitgezet. EC50-waarden worden aangegeven.
Wanneer het wordt geïsoleerd uit de bronplant, wordt natuurlijke niet-synthetische CBD meestal samen met andere cannabinoïden geëxtraheerd, wat de onvermijdelijke resterende complexiteit van natuurlijke producten vertegenwoordigt. Om te verifiëren dat CBD inderdaad verantwoordelijk is voor de virale remming, hebben we een CBD-referentiestandaard geanalyseerd, evenals CBD van drie verschillende bronnen voor zuiverheid met behulp van 100% kwantitatieve NMR (qNMR). Deze bronnen omvatten twee chemische leveranciers (Leveranciers A en B) en een commerciële leverancier die natuurlijke materialen gebruikte (Leverancier C).
De opvallende congruentie tussen de experimentele 1 H-NMR en het onlangs gevestigde kwantummechanische HiFSA ( 1 H Iteratieve Volledige Spin Analysis) profielen waargenomen voor alle materialen bevestigd dat 1) de gebruikte verbindingen waren inderdaad CBD met een zuiverheid van ten minste 97% (Afb. 1B) en 2) congenere cannabinoïden waren niet aanwezig in niveaus boven 1,0% ( 11 ). Analyse van deze verschillende CBD-preparaten in de virale A549-ACE2-infectietest toonde vergelijkbare EC50’s met een bereik van 0,6-1,8 M, wat waarschijnlijk de intrinsieke biologische variabiliteit van de test weerspiegelt (Afb. 1C). Er werd geen toxiciteit waargenomen voor een van de CBD-preparaten bij de doses die werden gebruikt om virale infectie te remmen ( fig. S1 E – G ).
CBD wordt vaak geconsumeerd als onderdeel van een C. sativa- extract, vooral in combinatie met psychoactieve THC verrijkt met marihuanaplanten. We hebben daarom bepaald of congenere cannabinoïden, vooral analogen met nauw verwante structuren en polariteiten geproduceerd door de hennepplant, ook in staat zijn om SARS-CoV-2-infectie te remmen. Opmerkelijk is dat alleen CBD een krachtig middel was, terwijl beperkte of geen antivirale activiteit werd vertoond door de structureel nauw verwante congeneren die biosyntheseroutes delen en de biogenetisch bepaalde resterende complexiteit vormen van CBD gezuiverd uit C. sativa : THC, cannabidiolzuur (CBDA), cannabidivarine (CBDV), cannabichromeen (CBC) of cannabigerol (CBG) (Afb. 2 A–B; zie Methoden). Geen van deze verbindingen was toxisch voor de A549-ACE2-cellen in het van belang zijnde dosisbereik ( fig. S2 ). Met name het combineren van CBD met THC (1:1) onderdrukte de werkzaamheid van CBD aanzienlijk in overeenstemming met competitieve remming door THC.
(A) A549-ACE2-cellen werden behandeld met aangegeven doses van verschillende cannabinoïden of een CBD/THC 1:1-mengsel gevolgd door infectie met SARS-CoV-2 met een MOI van 0,5 gedurende 48 uur. De cellen werden gekleurd op spike-eiwit en het percentage cellen dat het spike-eiwit in elke toestand tot expressie bracht, werd uitgezet. Alle geteste cannabinoïden werden geïsoleerd uit een hennepextract zoals beschreven in Methoden. (B) Chemische structuren van cannabinoïden en 7-OH CBD. (C)
A549-ACE2-cellen werden behandeld met aangegeven doses 7-OH CBD gevolgd door infectie met de SARS-CoV-2 met een MOI van 0,5. De cellen werden gekleurd op spike-eiwit en het percentage cellen dat het spike-eiwit in elke toestand tot expressie bracht, werd uitgezet. Representatieve gegevens van CBD uitFiguur 1C(Leverancier A) wordt gebruikt ter vergelijking. EC50-waarden worden aangegeven.
CBD wordt snel gemetaboliseerd in de lever en darmen tot twee hoofdmetabolieten, 7-carboxy-cannabidiol (7-COOH-CBD) en 7-hydroxy-cannabidiol (7-OH-CBD). Hoewel de niveaus van 7-COOH-CBD 40 keer hoger zijn dan die van 7-OH-CBD in menselijk plasma, is 7-OHCBD het actieve ingrediënt voor de behandeling van epilepsie ( 14 ). Net als CBD, maar in tegenstelling tot de andere cannabinoïden, remde 7-OH-CBD effectief de SARS-CoV-2-replicatie in A549-ACE2-cellen (EC50 3,6 M;Afb. 2C) en was niet-toxisch voor cellen ( fig. S2H ).
Analyse van bloedplasma gehalte bij gezonde patiënten die FDA-goedgekeurde CBD (Epidiolex ® ) een maximale concentratie (C max ) voor CBD in het nM traject dat 7-OH-CBD ac had max in het pM traject, vergelijkbaar met die waargenomen in gekweekte cellen ( 15 ). Deze resultaten suggereren dat CBD zelf niet aanwezig is in de niveaus die nodig zijn om SARS-CoV-2 bij mensen effectief te remmen. Daarentegen zijn de plasmaconcentraties van zijn metaboliet 7-OH-CBD, waarvan de Cmax meerdere keren kan worden verhoogd door gelijktijdige toediening van CBD met een vetrijke maaltijd, voldoende om SARS-CoV-2-infectie bij mensen mogelijk te remmen ( 15 ).
CBD zou kunnen werken om virale toegang tot gastheercellen te blokkeren of in latere stappen na infectie. Omdat werd aangetoond dat CBD de ACE2-expressie in sommige epitheelcellen, waaronder A549 ( 16 ) verlaagt , hebben we eerst bepaald of CBD de SARS-CoV-2-receptor onderdrukt in onze A549-ACE2 tot overexpressie brengende cellen. Er werd geen afname in ACE2-expressie waargenomen (Afb. 3A). Bovendien toonde analyse van lentivirussen die gepseudotypeerd waren met ofwel het SARS-CoV-2-spike-eiwit of het VSV-glycoproteïne ( 17 ) aan dat antilichaam tegen het spike-eiwit de virale infectie van het SARS-CoV-2, maar niet de VSV-G tot expressie brengende virussen blokkeerde. 10 μM CBD remde echter slechts gedeeltelijk de celinvoer door het spike-expresserende virus, wat suggereert dat andere mechanismen grotendeels verantwoordelijk waren voor de antivirale effecten (Afb. 3B, en vijgen. S3A en B ).
Daarentegen blokkeerden antilichamen tegen het spike-eiwit effectief de virale infectie van de SARS-CoV-2, maar niet van de virussen die VSV-G tot expressie brengen. In overeenstemming hiermee was CBD ook effectief in het remmen van de expressie van SARS-CoV-2 spike-eiwit in gastheercellen, zelfs 2 uur na infectie in aanwezigheid van antilichamen tegen het spike-eiwit om herinfectie gedurende deze periode te voorkomen (Afb. 3C,,NS).NS). Om te beoordelen of CBD de verwerking van virale eiwitten door de virale proteasen Mpro of PLpro zou kunnen voorkomen, hebben we hun activiteit in vitro getest ( fig. S4 ). CBD had geen invloed op de activiteit van beide proteases, waardoor de mogelijkheid ontstond dat CBD zich richt op gastheercelprocessen….
Lees verder bij de bron: Amerikaanse National Library of Medicine
